عنوان: توليد آنزيم فعال پراكسيداز گياهي در باكتري خلاصه اختراع: آنزيم¬هاي پراكسيداز گياهي يكي از پركاربردترين آنزيم¬ها بوده و در ساختارشان پيوند دي¬سولفيد داشته و براي فولد صحيح و فعاليت به كلسيم و هم (Heme) نياز دارند. تا كنون توليد نوتركيب اين آنزيم¬ها در سيستم پروكاريوتي به صورت اجسام غير¬فعال و نامحلول (اينكلوژن بادي) بوده كه بازيابي پروتئين به فرم محلول و فعال نياز به مراحل ريفولدنگ داشته است. ريفولدينگ علاوه بر هزينه بر بودن، زمانبر مي¬باشد و بخشي از پروتئين نيز طي فرايند از دست مي¬رود. در روش جديد، براي توليد ارزان و سريع پراكسيداز گياهي، از باكتري¬هاي مهندسي شده (مثل Escherichia coli T7 SHuffle) به عنوان ميزبان استفاده شد كه توانايي تشكيل پيوند دي سولفيدي را در سيتوپلاسم خود دارا مي-باشند. با تشكيل پيوندهاي دي¬سولفيدي، ساختار آنزيم به نحوي شكل مي¬گيرد كه با بهينه¬سازي اضافه نمودن كوفاكتورهاي آنزيم از قبيل كلسيم و هم به صورت مستقيم به محيط كشت، اين مواد در داخل باكتري در ساختار پروتئين قرار مي¬گيرند و پروتئين در حال توليد به سمت فرم محلول و فعال هدايت مي¬شود بطوريكه پس از تخليص قابل استفاده مي¬باشد. در اين روش ضمن توليد ارزانتر و سريعتر آنزيم، بازده توليد هم تقريبا دو برابر مي¬شود.

افزايش پايداري و فعاليت آنزيم¬ها در صنعت از اهميت ويژه¬اي برخوردار است. جهت افزايش عملكرد آنزيم¬ها در صنعت از روش¬هايي از قبيل تهيه آنزيم از سوش¬هاي پايدار، تكنيك¬هاي مهندسي پروتيئن و مهندسي محيط استفاده مي¬شود. در اين مطالعه بمنظور افزايش كارايي آنزيم نوتركيب پراكسيداز LDP (ژن آن از گياه Lepidium draba جداسازي و در وكتور بياني pET28a كلون شده بود) در صنعت از مهندسي محيط استفاده شد. LDP از لحاظ توالي اسيد آمينه، ساختار دوم و سوم و همچنين ويژگي¬هاي سينتيكي مي¬تواند به عنوان همولوگ HRP (Horseradish peroxidase) مطرح شده و جايگزيني براي استفاده از آن در صنايع مختلف باشد. HRP از پراكسيدازهاي گياهي كلاس III بوده و در زمينه¬هاي مختلفي از قبيل ساخت بيوسنسور¬ها، كيت¬هاي تشخيص طبي، سنتز مواد آلي، حذف فنول و تركيبات آروماتيك از فاضلاب¬ها مورد استفاده قرار مي¬گيرد. نتايج حاصله از اين تحقيق نشان دهنده آن است كه اضافه شدن اوره (تا به امروز به عنوان يك واسرشته كننده و غير فعال كننده آنزيم¬ها شناخته مي¬شده است) به محيط عملكردي آنزيم باعث افزايش فعاليت آن مي¬شود بطوريكه با افزايش غلظت اوره در محيط فعاليت آن افزايش نشان داد و بيشترين فعاليت آنزيم در حضور اوره 8 مولار مشاهده گرديد. همچنين پايداري دمايي آنزيم در حضور اوره 8 مولار افزايش نشان داد. بر اساس نتايج، در حضوره اوره 8 مولار محدوده pH عملكردي آنزيم تغيير نكرده، ولي فعاليت آنزيم بطور چشمگيري افزايش يافته بود. نتايج نشان داد كه آنزيم در حضور اوره 8 مولار در دماي 25 درجه سانتي¬گراد در مدت زمان 10 روز فعاليت خود را حفظ كرده و حتي تا روز دوم فعاليت آن افزايش يافته است. همچنين در حضور اوره 8 مولار، پارامترهاي سينتيكي آنزيم شامل تمايل آنزيم به سوبسترا و سرعت عملكرد آنزيم تغيير كرد. اين مشاهدات كه براي اولين بار در دنيا گزارش مي¬شود، بيانگر اين است كه با افزايش اوره به محيط واكنش اين آنزيم و در نتيجه افزايش پايداري و فعاليت آن، مي¬توان كارايي اين پراكسيداز را در صنعت افزايش داد.